氏名

カトウ タカシ

加藤 尚志

職名

教授 (https://researchmap.jp/read0205484/)

所属

(教育学部)

連絡先

住所・電話番号・fax番号

住所
〒162-8480新宿区 若松町2−2 早稲田大学 先端生命医科学センター
電話番号
03-5286-7309
fax番号
03-3355-0316

URL等

WebページURL

http://www.f.waseda.jp/tkato/index.html

研究者番号
80350388

本属以外の学内所属

兼担

理工学術院(大学院先進理工学研究科)

研究院(研究機関)/附属機関・学校(グローバルエデュケーションセンター)

学内研究所等

教育総合研究所

兼任研究員 1989年-

理工学総合研究センター

兼任研究員 2002年-2006年

ライフサポートイノベーション研究所

研究所員 2014年-2014年

ライフサポートイノベーション研究所

研究所員 2015年-

理工学術院総合研究所(理工学研究所)

兼任研究員 2006年-2018年

理工学術院総合研究所(理工学研究所)

兼任研究員 2018年-

学歴・学位

学歴

-1980年 早稲田大学 教育学部 理学科 生物学専修
-1982年 早稲田大学 理工学研究科 物理学及応用物理学専攻

学位

博士(理学) 論文 早稲田大学

経歴

1982年04月-キリンビール株式会社 総合研究所入社 技師
1982年04月-キリンビール株式会社 開発科学研究所 研究員
1986年04月-キリンビール株式会社 医薬開発研究所 研究員
1993年08月-キリンビール株式会社 医薬探索研究所 研究員
1994年03月-キリンビール株式会社 医薬探索研究所 主任研究員
1999年08月-キリンビール株式会社 医薬探索研究所 研究企画担当部長(兼務)
2000年01月-キリンビール株式会社 医薬探索研究所 主任研究員/癌分野リーダー[専任]
2001年04月-キリンビール株式会社 医薬探索研究所 主幹研究員/癌分野リーダー[専任]
2001年11月-キリンビール株式会社 医薬探索研究所 主幹研究員/研究推進担当部長
2002年03月-キリンビール株式会社 退職
2002年04月-早稲田大学 教育学部 理学科 生物学専修 教授
2002年12月-早稲田大学 理工学総合研究センター 客員研究員[兼担]
2003年04月-早稲田大学 大学院 理工学研究科 教授[兼担]
生命理工学専攻生命分子機能分野 分子生理学研究
2004年09月-早稲田大学 教育・総合科学学術院 教授
【学部】 教育学部
【大学院】 大学院 理工学研究科
(大学組織変更に伴う人事所属変更)
2007年04月-早稲田大学 教育・総合科学学術院 教授
【学部】 教育学部
【大学院】 大学院 先進理工学研究科
(大学院名称変更に伴う人事所属変更)
(兼)
2005年10月-〜2008年3月 慶応義塾大学 医学部 訪問教授
2006年04月-独立行政法人 日本原子力研究開発機構 量子ビーム応用研究部門 研究嘱託
2010年04月-独立行政法人 日本原子力研究開発機構 量子ビーム応用研究部門 客員研究員
2010年04月-静岡大学 大学院 客員教授

所属学協会

日本動物学会 理事(2018-19)

日本血液学会 評議員

日本生化学会

日本比較内分泌学会

米国血液学会

国際実験血液学会

量子生命科学会 運営委員

委員歴・役員歴(学外)

2005年-2006年経済産業省・独立行政法人 新エネルギー・産業技術総合開発機構[NEDO](株式会社KRI委託) 平成17年度 技術戦略マップ創薬・診断技術ローリングタスクフォース調査委員会 委員
2005年-2006年経済産業省・独立行政法人 新エネルギー・産業技術総合開発機構[NEDO](株式会社KRI委託) 平成17年度 技術戦略マップ合同タスクフォース調査委員会 委員
2005年-2006年(独)新エネルギー・産業技術総合開発機構[NEDO]委託事業 (社)バイオ産業情報化コンソーシアム 平成17年度「タンパク質機能解析・活用プロジェクト」研究推進委員会 委員
2004年-2005年経済産業省 「バイオ人材育成システム開発事業」(三井情報開発(株)委託・三菱総合研究所再委託) バイオ支援人材育成 開発委員会 委員長
2004年-2005年経済産業省・独立行政法人 新エネルギー・産業技術総合開発機構[NEDO](株式会社KRI委託) 平成17年度 技術戦略マップ策定 医薬品・診断薬技術開発戦略調査委員会 タスクフォース「ライフサイエンス分野」創薬診断技術戦略マップ検討委員会 委員
2003年-(財)新世代研究所 中性子生体ナノマシン研究会 委員
2003年-2004年経済産業省 「バイオ人材育成システム開発事業」(三菱総合研究所委託)評価委員会 委員
2003年-2004年経済産業省 「平成14年度起業家育成導入促進事業・技術経営プログラム等開発」(三菱総合研究所委託) 早稲田大学「21世紀に勝ち残る企業のイノベーションリーダー人材育成プログラム」 バイオテクノロジー事業化技術経営プログラム・開発責任者
2002年-科学技術振興事業団「地域研究開発促進拠点支援事業」群馬県医療・バイオ領域分科会 委員

取材ガイド

カテゴリー
生物学
専門分野
実験血液学、分子生理学、蛋白質科学
自己紹介コメント
創立50年の歴史をもつ教育学部生物学の現場で教育・研究を担当し、ヒト、カエル、メダカの血球機能や造血制御を研究中です。企業における赤血球、血小板産生因子(エリスロポエチン、トロンボポエチン)の基礎・開発研究の経験を反映させ、応用研究に貢献するには、まず基礎科学の研究能力を修練すべき、というポリシーで学生を育成し、臨床系、基礎系双方の学会で活動中です。大学院先進理工学研究科生命理工学専攻の教員を兼担。
キーワード
血球、バイオテクノロジー、創薬

研究分野

キーワード

生体高分子、生体機能関連物質、分子生理学、細胞生理学、動物生理・化学、造血制御、蛋白質化学、造血因子/サイトカイン

科研費分類

生物学 / 基礎生物学 / 形態・構造

生物学 / 生物科学 / 細胞生物学

複合領域 / 生体分子科学 / 生体分子化学

医歯薬学 / 基礎医学 / 生理学一般

研究テーマ履歴

幹細胞から末梢血球に至る造血系の 解析in vivo及び in vitro

国内共同研究

造血因子とその受容体の機能と発現の制御 (哺乳類・両生類・小型魚類)

個人研究

生体機能蛋白質の構造と機能

個人研究

血球産生とその制御

個人研究

造血因子の構造と機能

個人研究

論文

2002〜 現在の成果報告は、下記URLよりご参照ください。 http://www.f.waseda.jp/tkato/publ/publ-top.html

2004年-

Structural and biological properties of erythropoietin in Xenopus laevis

EXPERIMENTAL HEMATOLOGY38(5)p.363 - 3722010年-2010年

DOIWoS

詳細

ISSN:0301-472X

Identification of erythroid progenitors induced by erythropoietic activity in Xenopus laevis

JOURNAL OF EXPERIMENTAL BIOLOGY214(6)p.921 - 9272011年-2011年

DOIWoS

詳細

ISSN:0022-0949

THE PROPORTION OF HEPATIC HEMATOPOIETIC PROGENITOR CELLS IN XENOPUS LAEVIS DURING SYSTEMIC REMODELING AT METAMORPHOSIS

Fukunaga, Mike;Hirata, Akito;Mochizuki, Yoko;Aiso, Takaki;Tanizaki, Yuta;Hosozawa, Sakiko;Sato, Kei;Kato, Takashi

EXPERIMENTAL HEMATOLOGY44(9)p.S71 - S722016年-2016年

WoS

詳細

ISSN:0301-472X

Development of Erythroid Progenitors under Erythropoietin Stimulation in Xenopus laevis Larval Liver

Okui, Takehito; Hosozawa, Sakiko; Kohama, Satoka; Fujiyama, Shingo; Maekawa, Shun; Muto, Hiroshi; Kato, Takashi; Kato, Takashi

Zoological Science33(6)p.575 - 5822016年12月-2016年12月 

DOIScopus

詳細

ISSN:02890003

概要:© 2016 Zoological Society of Japan.Erythroid progenitors that respond to erythropoietin (Epo) are present in the liver of adult Xenopus laevis. However, cells responding to Epo in the larval liver and through the metamorphosis period under hepatic remodeling have not been characterized. In this study, tadpoles were staged using the tables of Nieuwkoop and Faber (NF). Liver cells from pre-(NF56) or post-(NF66) metamorphic stage were cultured in the presence of Epo. β2-globin mRNA expression peaked at day 7 after the start of culture. Larval β2-globin was highly expressed in NF56-derived cells, while adult β2-globinwas detected in those of NF66. In both NF56-and NF66-derived cells, mRNA expression of eporand gata2 peaked at day 5 and days 3-4, respectively. In contrast, gata1 expression peaked at day 6 in NF56 cells and at day 5 in NF66 cells. Half maximal proliferation of erythrocytic blast cells derived from the liver at NF66 was observed at day 3, which was earlier than that of NF56. These results indicate that erythroid progenitors that respond to Xenopus laevis Epo are maintained in pre-and post-metamorphic liver, although the tissue architecture changes dramatically during metamorphosis. Additionally, the globin switching occurred, and/or the erythroid progenitors for larval erythrocytes were replaced by those for adult erythrocytes in the metamorphic liver.

VISUALIZATION OF NUCLEATED ERYTHROCYTES AND THROMBOCYTES IN THE CIRCULATION WITH TWO-PHOTON MICROSCOPE

Ninao, Haruka;Nishimura, Satoshi;Sakata, Asuka;Murase, Ayaka;Tanizaki, Yuta;Kato, Takashi

EXPERIMENTAL HEMATOLOGY44(9)p.S92 - S932016年-2016年

WoS

詳細

ISSN:0301-472X

CHARACTERIZATION OF HEMATOPOIETIC STEM/PROGENITOR CELLS EXPANDED BY XLTPO STIMULATION IN XENOPUS

Tanizaki, Yuta;Mochizuki, Yoko;Aiso, Takaki;Watarai, Atsuko;Kato, Takashi

EXPERIMENTAL HEMATOLOGY44(9)p.S102 - S1022016年-2016年

WoS

詳細

ISSN:0301-472X

DIFFERENTIATION AND PROLIFERATION OF XENOPUS HEMATOPOIETIC PROGENITOR CELLS IN THE FATTY BONE MARROW

Aiso, Takaki;Tanizaki, Yuta;Mochizuki, Yoko;Fukunaga, Miku;Kato, Takashi

EXPERIMENTAL HEMATOLOGY44(9)p.S110 - S1102016年-2016年

WoS

詳細

ISSN:0301-472X

An insight into the thermodynamic characteristics of human thrombopoietin complexation with TN1 antibody

Arai, Shigeki;Shibazaki, Chie;Adachi, Motoyasu;Honjo, Eijiro;Tamada, Taro;Maeda, Yoshitake;Tahara, Tomoyuki;Kato, Takashi;Miyazaki, Hiroshi;Blaber, Michael;Kuroki, Ryota

PROTEIN SCIENCE25(10)p.1786 - 17962016年-2016年

DOIWoS

詳細

ISSN:0961-8368

アフリカツメガエルにおいてトロンボポエチンは肝臓での有核栓球の産生を誘導する

谷崎 祐太;一杉 芽美;大淵-下地 美也子;石田-岩田 貴子;田原-茂木 彩香;目黒-石川 瑞枝;加藤 尚志

比較内分泌学42(157)p.9 - 112016年-2016年

CiNii

詳細

ISSN:1882-6636

赤血球造血における比較血液学的視点

加藤 尚志;前川 峻;永澤 和道;奥井 武仁;谷崎 祐太

臨床血液57(7)p.925 - 9322016年-2016年

CiNii

詳細

ISSN:0485-1439

概要:

造血系は進化の過程で殆どの脊椎動物に保持され,中でも赤血球の存在は,脊椎動物に共通している。多様な動物種を対象とする比較生物学的アプローチは,生物の仕組みの理解の基礎になるのと同時に,未知の生体制御系の探索に展開可能である。最近ではゲノム情報を活用したオミクス解析や,全RNAシークエンシングなどの網羅的分子検索も可能になった。この技術革新によって,かつては分子実験手段を欠いた「非モデル」動物であっても,「モデル」動物化が急速に実現しつつあり,発見研究のパラダイムシフトとなりつつある。実験血液学においてもヒトやマウスに対象を限ることなく,様々な動物種の血球形態・機能,造血制御,造血因子の構造や作用などの解析を進めることによって,造血制御の多様性・普遍性の探求が可能である。特に動物の進化を考察する上で,赤血球造血は殆ど全ての脊椎動物で共有されている指標として位置づけることができる。

The influence of artificially introduced nglycosylation sites on the in vitro activity of xenopus laevis erythropoietin

Nagasawa, Kazumichi; Meguro, Mizue; Sato, Kei; Tanizaki, Yuta; Tanizaki, Yuta; Kosaka, Nami Nogawa; Kato, Takashi; Kato, Takashi

PLoS ONE10(4)2015年04月-2015年04月 

DOIScopus

詳細

概要:© 2015 Nagasawa et al. Erythropoietin (EPO), the primary regulator of erythropoiesis, is a heavily glycosylated protein found in humans and several other mammals. Intriguingly, we have previously found that EPO in Xenopus laevis (xlEPO) has no N-glycosylation sites, and cross-reacts with the human EPO (huEPO) receptor despite low homology with huEPO. In this study, we introduced N-glycosylation sites into wild-type xlEPO at the positions homologous to those in huEPO, and tested whether the glycosylated mutein retained its biological activity. Seven xlEPO muteins, containing 1-3 additional N-linked carbohydrates at positions 24, 38, and/ or 83, were expressed in COS-1 cells. The muteins exhibited lower secretion efficiency, higher hydrophilicity, and stronger acidic properties than the wild type. All muteins stimulated the proliferation of both cell lines, xlEPO receptor-expressing xlEPOR-FDC/P2 cells and huEPO receptor-expressing UT-7/EPO cells, in a dose-dependent manner. Thus, the muteins retained their in vitro biological activities. The maximum effect on xlEPOR-FDC/P2 proliferation was decreased by the addition of N-linked carbohydrates, but that on UT-7/ EPO proliferation was not changed, indicating that the muteins act as partial agonists to the xlEPO receptor, and near-full agonists to the huEPO receptor. Hence, the EPO-EPOR binding site in X. laevis locates the distal region of artificially introduced three N-glycosylation sites, demonstrating that the vital conformation to exert biological activity is conserved between humans and X. laevis, despite the low similarity in primary structures of EPO and EPOR.

Thrombopoietin induces production of nucleated thrombocytes from liver cells in Xenopus laevis

Tanizaki, Yuta; Ichisugi, Megumi; Obuchi-Shimoji, Miyako; Ishida-Iwata, Takako; Tahara-Mogi, Ayaka; Meguro-Ishikawa, Mizue; Kato, Takashi; Kato, Takashi

Scientific Reports52015年12月-2015年12月 

DOIScopus

詳細

概要:The development of mammalian megakaryocytes (MKs) and platelets, which are thought to be absent in non-mammals, is primarily regulated by the thrombopoietin (TPO)/Mpl system. Although non-mammals possess nucleated thrombocytes instead of platelets, the features of nucleated thrombocyte progenitors remain to be clarified. Here, we provide the general features of TPO using Xenopus laevis TPO (xlTPO). Hepatic and splenic cells were cultured in liquid suspension with recombinant xlTPO. These cells differentiated into large, round, polyploid CD41-expressing cells and were classified as X. laevis MKs, comparable to mammalian MKs. The subsequent culture of MKs after removal of xlTPO produced mature, spindle-shaped thrombocytes that were activated by thrombin, thereby altering their morphology. XlTPO induced MKs in cultured hepatic cells for at least three weeks; however, this was not observed in splenic cells; this result demonstrates the origin of early haematopoietic progenitors in the liver rather than the spleen. Additionally, xlTPO enhanced viability of peripheral thrombocytes, indicating the xlTPO-Mpl pathway stimulates anti-apoptotic in peripheral thrombocytes. The development of thrombocytes from MKs via the TPO-Mpl system in X. laevis plays a crucial role in their development from MKs, comparable to mammalian thrombopoiesis. Thus, our results offer insight into the cellular evolution of platelets/MKs in vertebrates. (200/200).

Characterization of rabbit limbal epithelial side population cells using RNA sequencing and single-cell qRT-PCR

Kameishi, Sumako; Kameishi, Sumako; Umemoto, Terumasa; Matsuzaki, Yu; Fujita, Masako; Okano, Teruo; Kato, Takashi; Kato, Takashi; Yamato, Masayuki

Biochemical and Biophysical Research Communications473(3)p.704 - 7092016年05月-2016年05月 

DOIScopus

詳細

ISSN:0006291X

概要:© 2015 Elsevier Inc. All rights reserved.Corneal epithelial stem cells reside in the limbus, a transitional zone between the cornea and conjunctiva, and are essential for maintaining homeostasis in the corneal epithelium. Although our previous studies demonstrated that rabbit limbal epithelial side population (SP) cells exhibit stem cell-like phenotypes with Hoechst 33342 staining, the different characteristics and/or populations of these cells remain unclear. Therefore, in this study, we determined the gene expression profiles of limbal epithelial SP cells by RNA sequencing using not only present public databases but also contigs that were created by de novo transcriptome assembly as references for mapping. Our transcriptome data indicated that limbal epithelial SP cells exhibited a stem cell-like phenotype compared with non-SP cells. Importantly, gene ontology analysis following RNA sequencing demonstrated that limbal epithelial SP cells exhibited significantly enhanced expression of mesenchymal/endothelial cell markers rather than epithelial cell markers. Furthermore, single-cell quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) demonstrated that the limbal epithelial SP population consisted of at least two immature cell populations with endothelial- or mesenchymal-like phenotypes. Therefore, our present results may propose the presence of a novel population of corneal epithelial stem cells distinct from conventional epithelial stem cells.

Effect of solution drift on crystalline morphology in the solution growth of off-axis 4H-SiC crystals

Kato, Takashi; Kusunoki, Kazuhiko; Kusunoki, Kazuhiko; Seki, Kazuaki; Okada, Nobuhiro; Kamei, Kazuhito

Materials Science Forum858p.65 - 682016年01月-2016年01月 

DOIScopus

詳細

ISSN:02555476

概要:© 2016 Trans Tech Publications, Switzerland.We investigated the effect of the solution flow on crystalline morphology in off-axis 4H-SiC solution growth. In particular, we focused on the relationship between the Si solution flow and step flow directions. In step parallel flow in which the solution drifted transversely to the step flow direction of the off-axis substrate, it was possible to attain a better surface morphology than when the solution drifted in the other direction. Furthermore, the surface morphology was found to be improved as the flow velocity increased. These improvements in morphological stability are presumed to be caused by the aligning of the solute concentration fluctuation along the steps.

Development of Erythroid Progenitors Under Erythropoietin Stimulation in Xenopus laevis Larval Liver

Okui, Takehito;Hosozawa, Sakiko;Kohama, Satoka;Fujiyama, Shingo;Maekawa, Shun;Muto, Hiroshi;Kato, Takashi

ZOOLOGICAL SCIENCE33(6)p.575 - 5822016年-2016年

DOIWoS

詳細

ISSN:0289-0003

An insight into the thermodynamic characteristics of human thrombopoietin complexation with TN1 antibody

Arai, Shigeki; Shibazaki, Chie; Adachi, Motoyasu; Honjo, Eijiro; Tamada, Taro; Maeda, Yoshitake; Tahara, Tomoyuki; Kato, Takashi; Miyazaki, Hiroshi; Blaber, Michael; Kuroki, Ryota

Protein Sciencep.1786 - 17962016年10月-2016年10月 

PubMedDOIScopus

詳細

ISSN:09618368

概要:© 2016 The Protein SocietyHuman thrombopoietin (hTPO) primarily stimulates megakaryocytopoiesis and platelet production and is neutralized by the mouse TN1 antibody. The thermodynamic characteristics of TN1 antibody–hTPO complexation were analyzed by isothermal titration calorimetry (ITC) using an antigen-binding fragment (Fab) derived from the TN1 antibody (TN1-Fab). To clarify the mechanism by which hTPO is recognized by TN1-Fab the conformation of free TN1-Fab was determined to a resolution of 2.0 Å using X-ray crystallography and compared with the hTPO-bound form of TN1-Fab determined by a previous study. This structural comparison revealed that the conformation of TN1-Fab does not substantially change after hTPO binding and a set of 15 water molecules is released from the antigen-binding site (paratope) of TN1-Fab upon hTPO complexation. Interestingly, the heat capacity change (ΔCp) measured by ITC (−1.52 ± 0.05 kJ mol−1 K−1) differed significantly from calculations based upon the X-ray structure data of the hTPO-bound and unbound forms of TN1-Fab (−1.02 ∼ 0.25 kJ mol−1 K−1) suggesting that hTPO undergoes an induced-fit conformational change combined with significant desolvation upon TN1-Fab binding. The results shed light on the structural biology associated with neutralizing antibody recognition.

Multiple origins of embryonic and tadpole myeloid cells in Xenopus laevis

Imai, Yasutaka; Ishida, Keisuke; Nemoto, Maya; Nakata, Keisuke; Kato, Takashi; Maéno, Mitsugu

Cell and Tissue Research369(2)p.341 - 3522017年08月-2017年08月 

DOIScopus

詳細

ISSN:0302766X

概要:© 2017, Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Rabbit anti-serum against a myeloid-cell-specific peroxidase (Mpo) of Xenopus laevis was generated to identify myeloid cells in adult and larval animals. Smears of blood samples from adult hematopoietic organs were co-stained with Mpo and with XL-2, a mouse monoclonal antibody against a leukocyte common antigen. Lymphocytes found in the thymus and spleen were XL-2 + Mpo − and granulocytes found in peripheral blood cells and the spleen were XL-2 + Mpo + , indicating that double-staining with these two antibodies allowed classification of the leukocyte lineages. Immunohistochemical analysis of larval organs showed that XL-2 + Mpo − cells were scattered throughout the liver, whereas XL-2 + Mpo + cells were present mainly in the cortex region. Interestingly, a cluster of XL-2 + Mpo + cells was found in the region of the larval mesonephric rudiment. The ratio of XL-2 + Mpo + cells to XL-2 + cells in the mesonephric region was approximately 80%, which was much higher than that found in other hematopoietic organs. In order to elucidate the embryonic origin of the myeloid cells in the tadpole mesonephros, grafting experiments between X. laevis and X. borealis embryos were performed to trace the X. borealis cells as donor cells. Among the embryonic tissues examined, the tailbud tissue at the early neurula stage contributed greatly to the myeloid cluster in the mesonephric region at stage 48. Therefore, at least four independent origins of the myeloid cell population can be traced in the Xenopus embryo.

Flow cytometric analysis of Xenopus laevis and X. tropicalis blood cells using acridine orange

2018年11月-2018年11月 

DOI

外部研究資金

科学研究費採択状況

研究種別:挑戦的萌芽研究

機械的刺激による血管弾性線維形成機序の解明

2010年-2011年

研究分野:生理学一般

配分額:¥3120000

研究種別:

超高解像度1分子蛍光顕微鏡の開発と細胞膜受容体の情報伝達機構の1分子解析

2009年-0月-2014年-0月

配分額:¥153010000

研究種別:

両生類胚の腹部血島の分化にかかわる新たな因子の同定と解析

配分額:¥5070000

研究種別:

赤血球産生における造血巣の組織形態的な特性と分子相互作用

配分額:¥4810000

研究種別:

両性類をモデルとした脳下垂体の発生、構造および機能に関する統合的研究

配分額:¥13200000

研究種別:基盤研究(C)

両生類における血球産生調節の環境応答に関する研究

2014年-2016年

研究分野:形態・構造

配分額:¥5070000

研究種別:基盤研究(C)

有害重金属の毒性発現に関与する細胞内タンパク凝集体の研究

2013年-2015年

研究分野:放射線・化学物質影響科学

配分額:¥5070000

研究種別:基盤研究(C)

両生類胚における血島の分化制御に関する総合的研究

2012年-2014年

研究分野:発生生物学

配分額:¥5460000

研究種別:基盤研究(C)

真核細胞が有する異常タンパク質識別機構に基づく有害物質評価系の確立

2010年-2012年

研究分野:放射線・化学物質影響科学

配分額:¥4290000

研究種別:

両生類の造血および血球形態・機能の低温応答に関する研究

2017年-0月-2020年-0月

配分額:¥4940000

研究種別:

両生類で発見された新たな胚体起源に由来する骨髄球の性状と発生意義

2016年-0月-2019年-0月

配分額:¥4940000

研究種別:

軟体動物の貝殻色素:その正体から模様形成へ

2014年-0月-2017年-0月

配分額:¥3640000

研究種別:

両生類における血球産生調節の環境応答に関する研究

2014年-0月-2017年-0月

配分額:¥5070000

研究種別:

有害重金属の毒性発現に関与する細胞内タンパク凝集体の研究

2013年-0月-2016年-0月

配分額:¥5070000

研究種別:

養育行動の分子基盤~Usp46変異マウスを活用して~

2013年-0月-2016年-0月

配分額:¥19370000

研究種別:

両生類胚における血島の分化制御に関する総合的研究

2012年-0月-2015年-0月

配分額:¥5460000

研究種別:

真核細胞が有する異常タンパク質識別機構に基づく有害物質評価系の確立

2010年-0月-2013年-0月

配分額:¥4290000

学内研究制度

特定課題研究

両生類血球の起源と造血組織動態の解明

2011年度共同研究者:前川峻

研究成果概要:脊椎動物の調節系の多様性と普遍性の研究が各種進められる中で,動物の血球産生調節の仕組みの統合的理解は進んでいない。膨大な種を含む脊椎動物のうち,赤血球とヘモグロビンとを持たない生物は,ウナギの幼生と,酸素を血中に溶存させる南極のコ...脊椎動物の調節系の多様性と普遍性の研究が各種進められる中で,動物の血球産生調節の仕組みの統合的理解は進んでいない。膨大な種を含む脊椎動物のうち,赤血球とヘモグロビンとを持たない生物は,ウナギの幼生と,酸素を血中に溶存させる南極のコオリウオ科魚類数種だけとされる(シュミット=ニールセン著,動物生理学~環境への適応,1997;沼田・中嶋監訳:東大出版,2007)。造血は脊椎動物共通の基幹系であり,種間で比較すれば,調節系の普遍性や多様性を論ずる良い題材である。本研究では,両生類アフリカツメガエルを対象に,造血発生や成体血球産生の機序の詳細な検討とともに,組織形態解析に立脚した造血解析に取り組んだ。アフリカツメガエル幼生(オタマジャクシ)では,赤血球造血発生に関して組織観察と遺伝子発現を検討した。発生段階NF52の組織をHE染色したところ肝臓の組織内に赤血球を認めた。NF56,60,66および成体の各組織の血球関連遺伝子の発現を解析したところ,NF56では赤血球分化に関わるgata-1・gata-2・エリスロポエチン(EPO)・EPO受容体・β-グロビンが肝臓・腎臓で発現していた。変態期の組織リモデリングの伴うNF60では腎臓でのgata-2・EPO・β-グロビンの発現が消失し,脾臓でこれらの遺伝子が発現するようになることから腎臓から脾臓へ赤血球造血巣の移行が示唆された。一方,これまでの我々の検討の結果,アフリカツメガエル成体の肝臓には,エリスロポエチン受容体発現細胞の約90%が類洞内に局在していることが判明している。そこでさらに成体肝臓における解析を進めた。o-dianisidine染色および透過型電子顕微鏡(TEM)観察により、ヘモグロビン含有赤芽球の局在を調べ、赤血球造血の微小環境を形成しうる接着分子vcam1, integrin alpha4, alpha5, beta1, macrophage erythroblast attacher(maea) 発現細胞との位置関係を明らかにした。また,栓球系の出現(前駆細胞からの増殖と分化)について,詳細な解析をした。ヒト,マウスと類似配列をもつTPO受容体(c-Mpl)を介した増殖分化をおこなう栓球前駆細胞が肝臓に存在したことから,栓球造血におけるTPO/c-Mpl系の生物種間の保存と生物活性の交叉を考察した。白血球系については,アフリカツメガエル顆粒球コロニー刺激因子(xlG-CSF)とその受容体G-CSFR(xlG-CSFR)の相同遺伝子配列を同定し、生物活性を検討した。xlG-CSF遺伝子をヒト胎児腎臓細胞株HEK293Tに導入し、組換え蛋白質を得た。一方、xlG-CSFR遺伝子を恒常発現するマウスFDC-P2細胞を得て、組換えxlG-CSFを本細胞株に添加したところ,明らかな増殖活性を示した。さらに、造血器由来細胞を組換えxlG-CSF存在下で培養し、出現する血球細胞中の好中球数を調べ,作用特異性を確認した。幼生,成体とも,肝臓で赤血球造血の直接証拠を獲得しつつあるが,それらの造血組織環境に,細胞接着因子ESAMが関与する可能性がある,ESAMは、動物44 種で報告されたが、アフリカツメガエルでは報告がない。近縁種ネッタイツメガエルESAM の遺伝子配列情報を利用して、アフリカツメガエルESAM の成熟蛋白質をコードする遺伝子配列を決定した。ヒトやメダカなどの一次構造と比較すると、塩基、アミノ酸それぞれの配列の一致率は低いが、機能領域、Cys 残基、N 結合型糖鎖の位置は保存されていた。造血巣である肝臓、脾臓、貧血成体の末梢血で発現することから、アフリカツメガエルのESAM 分子の発現は造血動態と関連することが示唆された。

メダカ造血と連鎖する甲状腺内分泌因子の研究

2011年度共同研究者:前川 峻

研究成果概要:造血系と内分泌系の研究は,これまでにそれぞれ独立した領域で展開されてきた。その結果,生理調節にいて相互に干渉・交差する分子機序の理解には至っていない。そこで我が国が世界に誇るべきモデル生物である小型魚類メダカを基礎生物学研究所ナシ...造血系と内分泌系の研究は,これまでにそれぞれ独立した領域で展開されてきた。その結果,生理調節にいて相互に干渉・交差する分子機序の理解には至っていない。そこで我が国が世界に誇るべきモデル生物である小型魚類メダカを基礎生物学研究所ナショナルバイオリソースプロジェクト(NBRP)(http://www.nbrp.jp/report/reportProject.jsp?project=medaka)より分与を受け,発生工学的手法を用いてin vivoで赤血球系譜特異的に甲状腺ホルモンの作用を阻害する実験系構築を行うこととした。その実験的手法の確立を目指し,本年度は,赤血球系細胞特異的に蛍光標識したトランスジェニック(Tg)メダカ作出を試みた。1.EPOR:DsRed Tgの作出赤血球造血因子エリスロポエチンの受容体(EPOR)遺伝子の5’上流転写調節領域(約4 kbp)を,メダカゲノムDNAから単離した。次いで単離遺伝子下流に,蛍光蛋白質DsRed遺伝子を含むベクターを構築した。本ベクターにはホーミングメガヌクレアーゼI-SceI認識配列を含んでおり,高効率的にゲノム内に組み込まれるように設計した。本遺伝子を,一細胞期のメダカ受精卵に,I-SceI酵素とともに共注入した。結果,蛍光顕微鏡観察により,受精後5日目には,血流を循環するDsRed陽性血球が多数確認された。2.GATA1:EGFP Tgの作出GATA1遺伝子座を含むBACクローン(基礎生物学研究所NBRPより譲渡)を用いて,大腸菌(SW102株, National Cancer Instituteより提供)内での相同組換え法によりGATA1遺伝子5’転写調節領域10 kbpを蛍光蛋白質EGFP遺伝子の上流に組み込んだ。本方法は,従来方と比較し,広領域の遺伝子を短期間でクローニング可能である。本遺伝子を1と同様にメダカ受精卵に微小注入した。結果,蛍光顕微鏡観察により受精後1日目の腹部血統領域にEGFP陽性細胞を確認できた。各Tgメダカは現在,世代交代により系統化を進めている。今後は上記Tgメダカ造血巣に存在す各赤血球系譜細胞をフローサイトメトリー法による同定・単離法の確立を進める。また,EPORやGATA1遺伝子の転写調節領域下流に甲状腺ホルモン受容体のドミナントネガティブ領域を組み込み,赤血球系細胞特異的に甲状腺ホルモンの効果を阻害するTgメダカの作出も合わせて行う予定である。

両生類造血巣が育む血球前駆細胞の成熟と末梢血球数調節

2012年度共同研究者:前川峻

研究成果概要:ほとんど全ての脊椎動物は,血球をもつ。したがって血球産生(造血)の科学は,地球上の様々な動物の多様性と普遍性の探求のすぐれた題材である。脊椎動物の血球は,酸素運搬を担う赤血球,生体防御を担う白血球,止血血栓形成を担う栓球(哺乳類の...ほとんど全ての脊椎動物は,血球をもつ。したがって血球産生(造血)の科学は,地球上の様々な動物の多様性と普遍性の探求のすぐれた題材である。脊椎動物の血球は,酸素運搬を担う赤血球,生体防御を担う白血球,止血血栓形成を担う栓球(哺乳類の脱核した血小板も栓球に含まれる)に大別される。それぞれ細胞形態も機能も異なるが,いずれも造血幹細胞を源として恒常的に派生する血球前駆細胞が増殖,分化,成熟し,末梢血管へ放出された細胞である。この過程を「造血」と呼ぶ。動物造血は基礎生物学・比較生物学の謎の宝庫の場であると確信する一方,全体を俯瞰する科学蓄積が乏しい。本研究は,進化序列と,造血の環境応答の興味から,特に両生類(アフリカツメガエル;Xenopus laevis,以後ツメガエル)の造血に焦点を当て,解析系立上げに尽力した。環境刺激としては,外温動物の特性を活かして,低温環境に暴露したツメガエルの汎血球減少症の機序の解明に焦点を当てた。特に赤血球減少について詳細な分析を進めたところ,低温環境に暴露されたツメガエルは,その急性期(低温暴露後1日以内)に,肝臓への循環赤血球の集積と破壊が起こることを突き止めた。この結果,赤血球造血の亢進を待たずに循環赤血球数が低下する。一方,恒温動物のマウスで同様の低温環境暴露モデルを解析したところ,一過性の末梢赤血球数の低下は起こるが,外温動物とは異なり,造血器そのものは体温に維持され,腎臓における赤血球産生因子エリスロポエチンのmRNA発現が亢進することが判明した。本研究の取り組みによって,ツメガエルにおける造血解析が徐々に精緻化できるようになり,このような比較実験生物学的な検討が可能となった。本研究の取り組みをはじめて10年を経過したが,研究成果を紹介する機会が徐々に増えてきた。特に最近,新しい題材として両生類造血に感心を寄せる研究者が増えつつあると実感している。

造血器の多様性に関する生物種間の比較解析

2013年度

研究成果概要:動物成体の主な造血器は,魚類は腎臓,両生類は肝臓や脾臓,哺乳類は骨髄が主となる。無尾両生類アフリカツメガエル(Xenopus laevis)は偽4倍体の染色体をもちゲノム量がヒトよりも多い。このため全ゲノム解読は,現在,文部科学省...動物成体の主な造血器は,魚類は腎臓,両生類は肝臓や脾臓,哺乳類は骨髄が主となる。無尾両生類アフリカツメガエル(Xenopus laevis)は偽4倍体の染色体をもちゲノム量がヒトよりも多い。このため全ゲノム解読は,現在,文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクト(NBRP)の指定動物となっている2倍体染色体のネッタイツメガエル(Xenopus tropicalis)が先となった。両種の外観形態,発生様式などは類似し,ゲノム情報をもち成長速度も速いネッタイツメガエルは,長い歴史をもつアフリカツメガエルモデルに代替される,と期待されてきた。実際,我々もアフリカツメガエルの造血研究を進める過程で,ネッタイツメガエルのゲノム情報を頻用してきた。アフリカツメガエルの肝臓は,赤血球造血をおこなうために赤色を呈する。ところが我々は偶然,ネッタイツメガエルの肝臓が黒色であることに気がついた。そしてネッタイツメガエルの造血器は,魚類のように腎臓なのではないか?という仮説を立てるに至った。本研究ではまず,両種の肝臓,脾臓,腎臓,肺,心臓の各組織を同一条件で顕微観察し,形態的所見を比較した。その結果,肝臓と腎臓に組織像に差異が認められた。造血能の差異について解析するため,造血器候補臓器より細胞を採取し,造血因子添加培養下,実際に血球が出現するかを調べた。また造血関連分子(造血因子,造血因子受容体,血球増殖・分化関連転写因子,血球系譜特異的表現型分子)について,in silico解析で造血関連分子の遺伝子配列を確定し,PCR法によって赤血球造血関連分子群の発現を比較した。以上の一連の実験によって,両種は近縁種ではあるが,肝臓と腎臓のそれぞれの造血能は必ずしも同等ではなく,アフリカツメガエルは造血能をより一層,肝臓にシフトさせており,一方,造血能を腎臓に残している所見が得られた。しかしNBRPからのフォローアップ情報によると,今回の検討の対象となったネッタイツメガエルが完全に健康ではなかった可能性があり,今後も引き続き精査の継続し,モデル生物構築の一環としてネッタイツメガエルの情報蓄積に貢献したい。

スポンジモデル検証を基礎とする両生類の血球産生調節の研究

2013年度

研究成果概要:本研究の最終目標は,動物における血球や血球産生(造血)の仕組みの多様性と普遍性を明らかにすることである。血球産生(造血)は,脊椎動物に共通した生命機構であり,地球上の様々な動物の多様性と普遍性の探求のすぐれた題材である。酸素運搬を...本研究の最終目標は,動物における血球や血球産生(造血)の仕組みの多様性と普遍性を明らかにすることである。血球産生(造血)は,脊椎動物に共通した生命機構であり,地球上の様々な動物の多様性と普遍性の探求のすぐれた題材である。酸素運搬を担う赤血球,生体防御を担う白血球,止血血栓形成を担う栓球(哺乳類の脱核した血小板も栓球に含まれる)のそれぞれは,いずれも造血幹細胞を源とする細胞である。本研究期間では,両生類(アフリカツメガエル;Xenopus laevis,以後ツメガエル)の造血を精査するために,血球関連分子と抗体の作出/赤血球造血因子エリスロポエチン(EPO)定量系/in vitro及び in vivoモデル確立など,各種の予備検討を進めた。ツメガエル赤血球造血器の肝臓には,ヒトやマウスに比較して1細胞あたりのEPO受容体数が圧倒的に多いと考えられ,この結果,過剰のEPO受容体がフリーのEPOを吸着し,赤血球産生量を決定する造血因子量を規定している可能性がある(スポンジモデル)。このことを実験的に検証するためには,様々な生物学的実験資源の調製が必要になる。その中でも,赤血球系細胞を特異的に検出するモノクローナル抗体と,EPO受容体を認識するモノクローナル抗体(xlEPOR MoAb)を作出することができた。特に後者に関しては,抗原免疫マウス脾臓とミエローマ細胞を融合させて得た約3000クローンのハイブリドーマの中から,本研究に有益を考えられる4クローンを選別した。それぞれのクローンが産生するモノクローナル抗体の化学的性質を精査し,さらにツメガエル肝臓,末梢赤血球,ツメガエルEPO受容体強制発現ヒト白血病細胞株などのEPO受容体に関して,免疫染色像,フローダイトグラムを検討することができた。今後,さらに獲得抗体の抗原特異性,細胞認識特異性,結合特異性を調べ,ツメガエル造血系解析に積極的に利用展開する。

質量分析による血球特異的抗体の抗原分子の解析

2015年度共同研究者:谷崎祐太(Yuta Tanizaki)

研究成果概要:脊椎動物の血液には多種多様の血球が存在し,これらの血球の形態や細胞腫には多様性が見いだされる。例えば哺乳動物は,無核赤血球,白血球,無核血小板をもつ。しかし魚類,両生類,爬虫類,鳥類は,赤血球は有核であり,小型細胞の血小板のかわり...脊椎動物の血液には多種多様の血球が存在し,これらの血球の形態や細胞腫には多様性が見いだされる。例えば哺乳動物は,無核赤血球,白血球,無核血小板をもつ。しかし魚類,両生類,爬虫類,鳥類は,赤血球は有核であり,小型細胞の血小板のかわりに有核栓球をもつ。このような血球あるいは血球産生(造血)の仕組みの違いは,脊椎動物の進化を考察する上で極めて重要な指標になると考えられる。ヒトやマウスの細胞の種類や性質を調べるためには,細胞発現蛋白質を特異的に認識する抗体が作出されて市販され,免疫染色によるフローサイトメトリーや組織染色が一般に普及している。あるいは全自動血算装置が市販されており機会計測による鑑別と計数が可能である。また,ゲノム情報を活用して分取した細胞に特異的に発現する遺伝子も容易に同定可能である。ところがヒトやマウス以外の動物の血球鑑別では利用可能な特異抗体は殆ど存在せず,免疫染色の適用はできず,機会計測法も利用できずにいる。我々はアフリカツメガエル,ネッタイツメガエル,メダカを対象に造血制御解析の新しいモデル動物確立を展開してきた(現在遂行中の科学研究費課題)。本研究では,表現型となる遺伝子が未知の動物血球に対して,その血球そのものを免疫抗原としてマウスに免疫(細胞免疫)してモノクローナル抗体を作出し,その未知抗原分子を同定する手法の開発を展開した。抗体の抗原分子決定法には,ペプチドオーバーラップ法,発現クローニング法など複数の選択肢がある。本研究では,我々が得意とするショットガン質量分析法(LC-MS/MS)を選択した。そして次の1)~5)の手順にて分析を進めた。1)抗体が認識する抗原細胞と抗体とを結合させる,2)両者をビーズ破砕する。3)Protein Gビーズによる免疫沈降法により,抗原抗体複合体を回収する,4)核酸・脂質除去後のトリプシン消化部分ペプチド群を質量分析へ進める,5)in silico解析し,抗原を同定する。このプロトコルでは界面活性剤の使用の有無,ビーズ破砕の条件,抗原抗体複合体の回収方法などについて,かなり厳密な最適化が必要であった。他にも細胞膜分子の糖鎖をビオチン化し,抗体が認識するビオチン化分子を濃縮後,同様の手順で質量分析し抗原分子を同定するなどの検討も必要だとおもわれた。本年度では,モデル実験によって再現性あるモノクローナル抗体の抗原分子同定までは至らずにいる。しかし細胞の前処理や蛋白質分子調製に関して,最適化に至る課題を洗い出すことができたため,どの研究室でも実施可能な標準手法の確立に向けて努力したい。

低温刺激で作動する脂肪髄の造血スイッチの研究

2017年度共同研究者:佐藤圭

研究成果概要:ツメガエル(ゼノパス)成体の造血は主に肝臓が担い,骨髄は脂肪髄化している。しかし低温刺激により,骨髄は赤色髄化し造血を開始する。このモデルを基礎にして,造血系に作用する組織環境の諸要素と分子機序を明らかにしたい。本研究では,加齢に...ツメガエル(ゼノパス)成体の造血は主に肝臓が担い,骨髄は脂肪髄化している。しかし低温刺激により,骨髄は赤色髄化し造血を開始する。このモデルを基礎にして,造血系に作用する組織環境の諸要素と分子機序を明らかにしたい。本研究では,加齢に伴う骨髄の脂肪髄化と環境低温応答の共役系の探索を進めた。本期間内では特に,低温曝露アフリカツメガエル(Xenopus laevis)モデルで,脂肪髄における血管新生と造血能亢進と,間葉系幹細胞からの脂肪細胞分化・骨形成能との間で連鎖する分子機序を探索した。

造血制御における低温応答系の分子機序の探索

2016年度共同研究者:谷崎祐太, 佐藤圭

研究成果概要:変温あるいは恒温動物とも,in vivo低温曝露によって,急性に末梢血球数が変動するが,造血や血球数調節の低温応答の分子機序は不明である。本研究では,両生類アフリカツメガエルに加え,新たにネッタイツメガエル(ナショナル・バイオリソ...変温あるいは恒温動物とも,in vivo低温曝露によって,急性に末梢血球数が変動するが,造血や血球数調節の低温応答の分子機序は不明である。本研究では,両生類アフリカツメガエルに加え,新たにネッタイツメガエル(ナショナル・バイオリソース・プロジェクトより分与)の末梢血球数変化の低温応答を解析した。これらより,低温ストレスによる栓球の血管内皮への可逆的接着,骨髄造血の変動等の現象の詳細を明らかにした。

両生類等における造血制御解析法の実験的確立

2002年度

研究成果概要:本研究では、代表的な外温生物である両生類アフリカツメガエル(Xenopus laevis laevis)を実験動物とし、新たな造血制御機構の探索を展開するために必要となる、血球系細胞の基礎的解析手法を検討した。成体アフリカツメガエ...本研究では、代表的な外温生物である両生類アフリカツメガエル(Xenopus laevis laevis)を実験動物とし、新たな造血制御機構の探索を展開するために必要となる、血球系細胞の基礎的解析手法を検討した。成体アフリカツメガエル末梢血を心採血し、塗沫標本ををMay-Grünwald-Giemsa染色、Hadji-Azimiら(1987)の分類に従って、各種血球の鑑別分類を行った。一方、臨床で用いられている自動血球計数装置(Sysmex F802)による末梢血球数の自動計数も検討したが、両生類のインタクトな血球の分別測定には粒度分布パラメータの設定や、血球前処理工程などに尚も工夫が必要であった。従って浮遊血球試料についてはcrystal violet染色血球をNeubauer血算盤で顕微観察により測定することとした。Percoll密度勾配法を実施し、赤血球と白血球は明確な分離が可能となった。また脾臓、肝臓、骨髄より細胞を回収し、染色標本で血球系細胞の存在を検討したところ、骨髄には脂肪が多く血球系細胞が少ないが、脾臓、肝臓には血球系細胞が多く見出された。すなわち、アフリカツメガエルの主たる造血巣は骨髄でなく、通常は脾臓や肝臓が造血の場であることを確認した。in vitroにおけるアフリカツメガエル血球系細胞の培養基礎条件を検討したところ、ウシ胎仔血清存在下、哺乳類で用いる細胞培養液を浸透圧調整後(7/9希釈)の培地によって、コロニーアッセイで必要とされる、少なくとも数日程度の培養が可能であることを確認した。外部環境に応答して造血系が変化する仕組みを解析する端緒として、アフリカツメガエルの末梢血球数変動の温度感受性を調べたところ、低温飼育後のアフリカツメガエルの末梢血球は半減することを確認した。以上の一連の研究は、生物における新たな造血制御系を探索を想定して、両生類による造血解析モデルの基礎的検討であり、今後、多様な実験系を確立する必要がある。この過程で解明される両生類造血の仕組みは、基礎生物学にとっても重要な知見を生むものと考えられた。本成果を基盤として、遺伝子組換えヒト造血因子への応答試験を含めた具体的な展開を予定している。

生物種を超える造血制御の環境応答

2004年度

研究成果概要:血球産生は動物の生存に重要な役割を担う。本研究では個体の置かれる環境ストレスに対する造血系の応答に着目した。例えば、低酸素体外培養後のヒト骨髄幹細胞の移植後再構築能の向上(Danet, et al. J .Clin Invest,...血球産生は動物の生存に重要な役割を担う。本研究では個体の置かれる環境ストレスに対する造血系の応答に着目した。例えば、低酸素体外培養後のヒト骨髄幹細胞の移植後再構築能の向上(Danet, et al. J .Clin Invest, 2003)、造血微小環境の変化による移植造血幹細胞の体内生着率変動など、生体内外の造血環境は、血球産生に大きく作用する。また、脊椎動物、特に両生類では、季節・性周期や棲息環境・発生段階の変化によって、主要造血器は、骨髄、腎臓、脾臓、肝臓などの臓器間で移動する。その仕組みを外温生物である無尾両生類アフリカツメガエル(ゼノパス:Xenopus laevis)をモデルにして、包括的理解を進めるために必要とする基礎的手法の開発、ならびに実際に個体への温度環境負荷に依存する末梢血球数の変動について調べた。環境ストレスとして、まず低温環境を選択し、飼育温度の変化に応答するin vivo造血変動を調べた。<造血制御の温度依存性>ゼノパスを25℃(常温)で飼育後、10℃の低温下へ飼育環境を移行して経時採血を行ったところ、各種末梢血球数は徐々に減少し始め、特に赤血球は約3週間で常温時の40%ほどに減少し、その後一定数に保たれた。再び常温飼育下に移行することで、これら血球数は、ほぼ元の値まで可逆的に回復した。血球数回復時の末梢血球のMGG(メイ・グリュンワルド-ギムザ)染色像を観察すると、常温飼育では末梢血中にはほとんど観察できない幼若な赤血球が多く出現しことから、低温応答によって血球産生が亢進していることが示された。<ゼノパス造血における脾臓の機能解析>脾摘ゼノパスを作出し、脾摘後の末梢血球数変動を観察した。脾摘直後、一旦減少した栓球数は術後20日目までに大幅に増加し、約一ヵ月後に正常値に回復した。また、脾内細胞をMGG染色にて観察すると、栓球様の細胞が多数見られる。これらの結果から、脾臓は環境変動負荷における末梢血中の栓球数調節に密接な役割を担っていることが示された。今後は、以上の結果を踏まえて、環境ストレスに暴露された血球系細胞の増殖・分化・機能や細胞局在を観察し、細胞質と核内で発現が変動する分子を発掘していく予定である。注目すべき分子を蛋白質化学・分子生物学的な手法によって探査選別、同定を進め、次いで当該遺伝子の機能発現動物モデルにおいて、造血器の組織形態の変化、末梢血球数の変動を調べ、これらの分子機能の検証へ進めていきたい。

ナノ・レベルで血液に存在する生体因子の発掘と解析

2004年度共同研究者:菊山榮

研究成果概要:内分泌ホルモンや細胞増殖・分化誘導因子等(サイトカイン・インターロイキン等)などを代表例として、生体試料に存在する微量蛋白質は、生体調節機能を有する場合が多い。しかし微量であるがゆえに、それらの蛋白質を単離し分子構造を同定する作業...内分泌ホルモンや細胞増殖・分化誘導因子等(サイトカイン・インターロイキン等)などを代表例として、生体試料に存在する微量蛋白質は、生体調節機能を有する場合が多い。しかし微量であるがゆえに、それらの蛋白質を単離し分子構造を同定する作業は古くから非常に困難な作業であって、このことは全ゲノム配列が判明した生物種を対象としても変ることがない。むしろ後者の場合は、ポストゲノム情報として今後益々、蛋白質の機能情報の獲得は重要な課題となってきた。本研究は、血液循環中に微量(サブμg・サブng/ml)に存在する生体機能蛋白質、即ち、大量の主要血液蛋白質の存在に隠れ、通常の方法では分離・検出されずにいるか、未発見である微量蛋白質の分離を免疫学的手法を活用することにより、簡便かつ網羅的な高純度濃縮・精製を実現する手法概念の実証を目的とした。さらに進化生物学上、種として重要な位置にありながらゲノム解析が未着手であり、個体からの採取血液量が限られる両生類(アフリカツメガエル、ウシガエル、イモリ等)を実験対象とし、存在の検証に続いて、生物学的研究を進める意義の深い分子群について、蛋白質化学的な分子性状を解明する手段として適用する手法を目指した。実験モデルとして、無尾両生類アフリカツメガエルの血中微量蛋白質の分離を試行した。まず血液中の主要蛋白質を認識するポリクローナルウサギ抗体の作製を行い、精製抗体を固相に固定化し、主要蛋白質群を抗体吸着画分として出発材料から除くクロマトグラフィーを調製した。第一段階の抗体結合性吸着画分には約90%の蛋白質が吸着した。更に、第一段階の抗体カラムの非吸着画分を抗原にして抗体を作製し、第二段階のクロマトグラフィーを組み立て、得られる画分の成分変化を調べた。この結果、血液総蛋白質の90%以上の除去に成功し、2ステップで得られた蛋白質中にプロラクチンなどの生体微量分子が高い回収率で濃縮可能であった。以上のように、精製初期段階で夾雑蛋白質を簡便迅速に除去できれば、精製ステップ数の低減や、活性の維持や精製純度を高める有効な手段となることが示された。今後は他のクロマトグラフィーとの併用によって、高純度の微量蛋白質画分を調製し、質量分析などを適用することによって、分子同定を進める道が拓かれた。

造血巣の形成と臓器間移動に関する解析

2005年度

研究成果概要:骨髄、脾臓、肝臓、腎臓を造血巣として使い分ける両生類成体(ゼノパス)を実験モデルとして、造血巣の個体内移動における血球系細胞とその環境の質的変化を、造血微小環境を視点の中心として明らかにすることが本研究の目的である。ゼノパスの造血...骨髄、脾臓、肝臓、腎臓を造血巣として使い分ける両生類成体(ゼノパス)を実験モデルとして、造血巣の個体内移動における血球系細胞とその環境の質的変化を、造血微小環境を視点の中心として明らかにすることが本研究の目的である。ゼノパスの造血幹細胞のマーカーの同定と分離法、諸造血関連分子の同定などの技術基盤が大幅に進展し、造血巣を構成する分化血球の分布について、1)in situハイブリダーゼーション法による発現遺伝子(mRNA)の細胞組織形態解析を進めた、2)非哺乳類で初めて主要造血因子の遺伝子を分離同定し、それらの構造を明らかにした(データベースへ登録)、3)両生類赤血球前駆細胞のin vitroコロニー細胞培養の最適化に成功し、レトロスペクティブな手法によって、個体内の造血幹細胞の局在や、血球産生の動態を正確にとらえる手法を確立した。また個体内のダイナミックな造血動態を解析するために、全く新たな造血解析モデルを作出した。これらは低温飼育による慢性血球減少症モデルや抗ゼノパス血球モノクローナル抗体投与モデルであるが、これら各モデルの末梢血球変動や、血球系細胞の寿命変動に関して、独自に作成した各種のモノクローナル抗体を適用して、レーザー蛍光細胞分析分離装置によるフローサートメトリーや蛍光免疫細胞染色によって解析した。同時に、ゼノパスの赤血球寿命が100日以上であることや、栓球寿命が1週間以上であるなどの基礎生物学における新たな学術成果も得た。また血球数減少期や回復期にある時、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓にある血球細胞の分布(位置と種類)の変動、あるいは各造血巣と周辺組織の細胞相互の位置について、組織連続切片や細胞染色標本を用いた精査に着手することができた。以上の取組みは、現在ヒト造血幹細胞移植療法や再生医療の将来へ向けて課題になっている造血巣の性質に関する基礎的解明と連鎖する成果となり、造血巣に出現する造血幹細胞の由来や、生物種に普遍的な造血能を代償する未知の制御系の発見へ繋がるユニークな取組みとして国内外より注目されつつある。

血小板産生調節におけるトロンボポエチン-Mpl系の分子動態

2005年度

研究成果概要:巨核球や巨核球前駆細胞に発現する細胞膜受容体c-Mplは、血液循環中にある血小板産生因子トロンボポエチン(Thrombopoietin ; TPO)と会合し、標的細胞の増殖と分化を引起こすシグナル伝達系を作動させる。新たに血液循環...巨核球や巨核球前駆細胞に発現する細胞膜受容体c-Mplは、血液循環中にある血小板産生因子トロンボポエチン(Thrombopoietin ; TPO)と会合し、標的細胞の増殖と分化を引起こすシグナル伝達系を作動させる。新たに血液循環に供給される血小板の産生は、このTPO-c-Mpl系が主要な役割を担う。1細胞の中の、TPO-c-Mplの1複合体が実際に局在転移を起こして細胞に内在化し、その後c-Mplのみが再び細胞膜上にリサイクリングされる過程を直接観察するため、まず蛍光で可視化可能なc-Mplを発現する細胞を作出した。具体的にはFDCPマウス白血病細胞株を発現宿主とし、遺伝子クローニングしたマウスc-mplを強制発現導入した細胞株を樹立した。この時、重合体を形成しにくい緑色蛍光蛋白質eGFPの変異遺伝子をタンデムに連結させ、c-MplのN末端側(細胞外領域)あるいはC末端側(細胞内領域)に緑色蛍光をもつc-Mpl誘導体発現キメラ遺伝子を導入した。その結果、共焦点レーザー蛍光顕微鏡によって、双方のキメラ遺伝子ともにそれぞれが発現する細胞株を取得することに成功したことが確認された。一方、特殊な無細胞蛋白質合成系を利用して、c-MplのリガンドとなるTPO部分長分子のC末端側に蛍光色素を共有結合させた分子の取得に成功した。これらの細胞は遺伝子組換えTPOの存在下で細胞増殖能を獲得した。続いて生物物理学分野の共同研究者である東京大学薬学部船津高志教授とともに、レーザーを光源とした精密な顕微分子計測系(生体分子の一分子計測・可視化技術)による、1細胞における蛍光標識TPOあるいは蛍光標識c-Mplの観察に着手した。顕微観察系は構築可能であり、蛍光標識c-Mpl発現量の異なる細胞亜株をサブクローニングして、観察する細胞株のファインチューニングを継続して実施している。以上のことからサイトカインおよびその受容体の双方に異なる蛍光をもつ分子を利用した解析系構築に目処がたち、【標的細胞におけるTPO-c-Mpl複合体の局在変化】の解明へ向けた世界初の実験検証系の確立となった。

血球細胞の最終分化の場における分子間作用と組織特性

2007年度

研究成果概要:本研究は,分化方向が決定した血球細胞の最終分化の組織環境(場の形成)について注目し,以下の課題に取り組んだ。1)新規の動物モデルを構築する2)血球数異常を呈する動物個体の血球産生の動態を多面的に解析する3)細胞の最終分化の場の組織...本研究は,分化方向が決定した血球細胞の最終分化の組織環境(場の形成)について注目し,以下の課題に取り組んだ。1)新規の動物モデルを構築する2)血球数異常を呈する動物個体の血球産生の動態を多面的に解析する3)細胞の最終分化の場の組織特性と,細胞相互および分子相互の関係を解析する1)について鋭意展開した結果,各種の造血因子とその受容体の構造を明らかにしつつあり,分子的な理解を進めることが可能となる世界的にも貴重な新しい造血解析モデルが誕生しつつある。またゼノパスのEPOは,種を超えてヒトEPO受容体強制発現細胞の増殖を刺激することを確認した。2)については,主要三血球系統の前駆細胞が増殖して最終分化に至るには,造血因子が必要であるので,既に取得したEPO,G-CSF,TPOのゼノパス相同遺伝子を動物細胞あるいは大腸菌で発現させて組換え蛋白質を取得した。一方,糖鎖付加,組織発現,活性などの基本を調べ,特に,哺乳類のin vivo活性に必須のN-結合型糖鎖が付加されないゼノパスEPOについては大腸菌発現系に注力し,結晶構造解析による種間交差性活性構造相関の解析の準備を進めた。同時にこれらの造血因子と受容体の抗体作製も進めた。さらに正常個体や溶血性貧血個体の肝臓,脾臓,骨髄,腎臓などの造血器における血球産生局在の全体像を,特異発現遺伝子を用いたin situ染色組織像と,フローサイトメトリーの両者を併用して明らかにしつつある。3)については,ゼノパスEPO分子には,N型糖鎖の付加がないことを見出し,肝臓においてEPO産生細胞と,血管外にあるEPO受容体を発現する赤血球前駆細胞が肝微小環境で相互に作用しあって赤血球産生の場を形成しているとするという新たな造血モデルを検証した。また,胎生期のヒトやマウスの肝臓でも,細胞接着因子群も加わって同様の環境が機能している可能性があり,種固有性に十分留意しつつ,種を超えた解釈を進める実験展開を進めた。

海外研究活動

研究課題名: 血球の性質と造血動態に関する総合的研究

2013年10月-2014年03月

機関: スミソニアン博物館(アメリカ)

現在担当している科目

科目名開講学部・研究科開講年度学期
分子生理学II教育学部2019秋学期
分子生理学I教育学部2019春学期
生物学基礎実験II教育学部2019秋学期
生態学I教育学部2019春学期
生物学演習教育学部2019通年
生物学実験IV教育学部2019通年
生物学特殊演習 D教育学部2019通年
生命科学探索法教育学部2019秋学期
修士論文(生命理工)大学院先進理工学研究科2019通年
Research on Molecular Physiology大学院先進理工学研究科2019通年
分子生理学研究大学院先進理工学研究科2019通年
総合生命理工学特論A大学院先進理工学研究科2019春学期
Integrative Bioscience and Biomedical Engineering A大学院先進理工学研究科2019春学期
総合生命理工学特論A大学院先進理工学研究科2019春学期
Integrative Bioscience and Biomedical Engineering B大学院先進理工学研究科2019秋学期
総合生命理工学特論B大学院先進理工学研究科2019秋学期
Molecular Physiology大学院先進理工学研究科2019春学期
分子機能生理学特論大学院先進理工学研究科2019春学期
Seminar on Molecular Functions and Physiology A大学院先進理工学研究科2019春学期
分子機能生理学演習A大学院先進理工学研究科2019春学期
Seminar on Molecular Functions and Physiology B大学院先進理工学研究科2019秋学期
分子機能生理学演習B大学院先進理工学研究科2019秋学期
Seminar on Molecular Functions and Physiology C大学院先進理工学研究科2019春学期
分子機能生理学演習C大学院先進理工学研究科2019春学期
Seminar on Molecular Functions and Physiology D大学院先進理工学研究科2019秋学期
分子機能生理学演習D大学院先進理工学研究科2019秋学期
Master's Thesis (Department of Integrative Bioscience and Biomedical Engineering)大学院先進理工学研究科2019通年
分子生理学研究大学院先進理工学研究科2019通年